В связи с изменением курса валют цены на сайте могут отличаться от актуальных.
Уточняйте цены у менеджера!
-
Закрытие перфорации мембраны Шнейдера
-
Восстановление дефектов твердого и мягкого неба
-
Реставрация рецессии в области зубов или имплантатов
-
Пародонтологические операции
-
Вестибулопластика
-
Реконструкция ороговевших десен
-
Изменение биотипа тканей
Стоматологическая мембрана имеет определенные параметры и набор характеристик, это толщина, плотность поверхности, модуль упругости, поверхностное натяжение, напряжение или удлинение при растяжении. Благодаря этим характеристикам можно прогнозировать поведение мембраны после имплантации, рассчитать время резорбции, прочность и другие свойства. В данной работе проведен сравнительный анализ физико-механических свойств новой стоматологической мембраны.
Разработкой и исследованием свойств материалов для восстановления и замещения поврежденных тканей занимаются многие исследователи по всему миру. По-прежнему актуальной является тема создания биологических материалов с заданными свойствами, а поиск «идеального» материала для выполнения пластических операций продолжается. Последние достижения регенеративной медицины доказывают преимущества использования комбинированных тканеинженерных конструктов с биологически активными агентами перед простыми инертными матрицами. Вместе с тем наблюдается рост популярности имплантируемых медицинских изделий на основе использования внеклеточного коллагенового матрикса (ВКМ). Последний имеет отличительные особенности в поведении и может выступать как в роли скаффолда для роста клеточных культур, так и самостоятельной матрицей для трансформации в здоровые ткани реципиента. Это происходит благодаря природному содержанию биологически активных компонентов (фибронектины, гликозаминогликаны, цитокины, факторы роста), которые после необходимого режима обработки остаются в имплантате и за счет своего фонового содержания провоцируют клеточную адгезию, пролиферацию и миграцию клеток. В результате имплантат на основе ВКМ не образует рубцов и спаек и после имплантации «заселяется» клетками реципиента. На основе внеклеточного матрикса созданы десятки медицинских изделий в самых разных областях медицины, что доказывает перспективность его использования в зоне регенерации.
Целью данной работы стало проведение анализа физико-механических параметров стоматологических мембран на основе внеклеточного матрикса в эксперименте.
Материал и методы исследования: Внеклеточный коллагеновый матрикс (ВКМ) представляет собой ацеллюлярный лиофилизированный однослойный или многослойный тканевый конструкт на основе подслизистой тонкой кишки свиньи (производитель ООО «Кардиоплант»). На фото 1 внешний вид лиофилизированного внеклеточного матрикса.
Данный биоматериал получен путем химико-биологической обработки ткани ксеногенного происхождения, обладает прекрасной биосовместимостью, высокой скоростью биоинтеграции и способностью замещаться на собственные здоровые ткани без образования рубцов, а также механической прочностью. Установлены хорошая адгезия и высокий уровень роста клеточных культур на нем.
Ключевые этапы процесса изготовления внеклеточного матрикса и их краткая характеристика представлены в таблице 1 Технологическая схема производства коллагенового внеклеточного матрикса.
Этап процесса |
Основная задача этапа |
Механическая чистка |
Предварительная очистка сырья ксеногенного происхождения |
Химико-биологическая обработка |
Необходима для повышения биосовместимости материала за счет снижения его видоспецифичности. Происходит разрушение и удаление клеток и их компонентов — основных факторов иммуногенности |
Обработка сшивающим агентом |
Придание готовому биоматериалу необходимых физико-механических и прочностных характеристик, а также создание конструктов необходимой толщины |
Лиофильная сушка |
Консервация биоматериала |
Химико-биологическая обработка обеспечивает сохранение целостности волокон нативной соединительной ткани, отвечающих за прочностные характеристики биоматериала, и за счет удаления клеточных элементов способствует уменьшению выраженности воспалительной реакции, возникающей в ответ на имплантацию материала в организм реципиента.
Схематичное изображение этапа химико-биологической обработки коллагенового внеклеточного матрикса:
Обработка сырья растворами с повышенной осмотической активностью для дегидратации и лизиса клеток |
Инкубация биоматериала в растворах биологически активного компонента для разрушения клеточных элементов |
Инактивация и нейтрализация для прекращения действия биологически активного компонента и предотвращения разрушения архитектоники нативной ткани и сохранения структуры волокон |
Обработка сырья растворами с повышенной осмотической активностью для полного удаления клеточных элементов |
Гистологический контроль для оценки эффективности обработки |
Для оценки эффективности химико-биологической обработки используют стандартные гистологические техники окрашивания препаратов гематоксилином-эозином (обнаружение клеточных элементов) и по методу Вейгерт-Ван-Гизона (определение сохранности волокон).
На фото 2(А-В) результаты гистологического исследования внеклеточного матрикса до (А) и после химико-биологической обработки (Б). Окраска гематоксилин-эозин, увеличение 200× (В) Окраска по Вейгерт-Ван-Гизону, ув. 200×
Полученный материал упаковывается в газопроницаемые пакеты и стерилизуется окисью этилена.
Описание основных компонентов коллагенового внеклеточного матрикса. Химико-биологическая обработка ксеноткани позволяет удалить клеточные элементы — основные факторы иммуногенности, сохранив при этом пространственную структуру нативной соединительной ткани. Субсерозная поверность образована коллагеновыми и ретикулярными фибриллами, нитями эластина различного диаметра, в то время как субмукозная поверхность является более гладкой.
Толщина одного слоя ВКМ составляет приблизительно 0,05–0,22 мм. Материал имеет переменную пористую структуру с порами от 20 до 30 мкм, что способствует диффузии кислорода, необходимого для поддержания пролиферации и жизнеспособности клеток. Коэффициент диффузии кислорода составляет 7 × 10-6–2 × 10–5 см2/с.
Пространственная архитектоника биоматериала определяется содержанием в составе ВКМ нерастворимых фибриллярных белков с высокой молекулярной массой (фото 3): коллагены, эластин, ламинины, фибронектины. Они обеспечивают механические свойства ткани.
Основу составляют коллагены типа I, в меньшем количестве коллагены типов III, IV, VI и эластин. Коллагены типов I и III собираются в фибриллы (до 500 нм в диаметре), которые могут сливаться с образованием более крупных волокон коллагена. Размер и диаметр коллагеновых волокон регулируются протеогликанами.
Коллагеновые волокна стабилизируются ковалентными сшивками, что делает эти структуры очень устойчивыми к механическим нагрузкам. Молекулы коллагена IV типа собираются в гексамерные структуры, которые формируют двухмерную сеть внеклеточного матрикса, поддерживаемую ковалентными сшивками с остатками метионина и лизина. Коллаген VI типа является короткоцепочечным белком, образующим микрофибриллы между крупными коллагеновыми волокнами.
Эластин организован в волокна, тесно связанные с фибриллярными коллагенами. Синтезируется в виде тропоэластина — мономерного растворимого предшественника с молекулярной массой 60–70 кДа, содержащего гидрофобные домены. Сборка мономеров тропоэластина в эластиновые волокона происходит автоматически, структура стабилизируется за счет формирования поперечных сшивок через остатки лизина. Эластиновые волокна нерастворимы, характеризуются высокой стабильностью, устойчивостью к ферментативной деградации и солюбилизации в водных растворах, способностью растягиваться и сжиматься в различных направлениях, сохраняя высокую прочность на разрыв, что обеспечивает эластичность ткани.
Фибронектины представляют собой димерные гликопротеины с молекулярной массой 500 кДа, состоящие из двух различных субъединиц, связанных между собой двумя дисульфидными мостиками С-концевыми участками. Существуют различные формы фибронектинов, кодируемые одним геном, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга мРНК. Диаметр волокон варьируется от 10 нм до 1 мкм. Полипептидные цепи фибронектина содержат центры специфического взаимодействия с коллагенами, протеогликанами, фибринами и клетками через интегрины. Фибронектин вовлекается в разнообразные процессы: способствует адгезии, стимулирует пролиферацию и миграцию клеток, контролирует дифференцировку клеток, участвует в развитии воспалительных и репаративных процессов.
Ламинины представляют собой гетеротримерные гликопротеины (одна альфа-, одна бета- и одна гаммацепь) с молекулярной массой от 400 до 900 кДа. Известны 5-альфа, 3-бета и 3-гамма цепи, которые могут формировать 16 различных изоформ белков. Ламинины автоматически собираются в сети, чередующиеся с сетью коллагена типа IV. Ламиннины имеют центры специфического связывания с различными молекулами внеклеточного матрикса и клетками через интегрины. Влияют на рост, морфологию, дифференцировку, миграцию и адгезию клеток. Гликозаминогликаны и протеогликаны, такие как хондроитин-сульфат А, дерматан-сульфат, гепарин, гепа‑ ран-сульфат, гиалуроновая кислота, являются основными компонентами соединительной ткани и обеспечивают связывание клеток и факторов роста, усиливают клеточную миграцию. Гепарин и гепаран-сульфат стимулируют ангиогенез, клеточную дифференциацию и пролиферацию клеток. Дерматан-сульфат и гиалуроновая кислота регулируют пространственную структуру коллагенового внеклеточного матрикса за счет контроля размера и ориентации формирующихся новых коллагеновых фибрилл. При физиологических значениях рН цепи гликозаминогликанов имеют отрицательный заряд, обусловленный наличием карбоксильных и сульфогрупп, что делает их сильно гидрофильными, и в связи с этим они играют важную роль в гидратации ткани.
Растворимые глобулярные белки факторы роста и цитокины связаны с сетью структурных белков биоматериала. Они играют важную роль в общей биологической активности ВКМ, в клеточной сигнализации и ремоделировании ткани в организме реципиента. По мере биодеградации материала происходит постепенное высвобождение факторов роста, в том числе факторов роста фибробластов, трансформирующего фактора роста-β1 и фактора роста эндотелия сосудов. Факторы роста фибробластов являются митогенами для различных клеток нейроэктодермального и мезенхимального происхождения, потенциальными митогенами и стимуляторами ангиогенеза, поддерживают и стимулируют дифференцировку клеток различных типов, что играет важную роль в развитии репаративных процессов после оперативного вмешательства.
Трансформирующий фактор роста-β1 подавляет гемопоэз, синтез воспалительных цитокинов, ответ лимфоцитов на IL‑2, —4 и –7, формирование цитотоксических NK и Т-клеток. В то же время он усиливает синтез белков межклеточного матрикса, способствует заживлению ран, оказывает анаболическое действие, стимулирует ангиогенез. В отношении полиморфоядерных лейкоцитов выступает как антагонист воспалительных цитокинов.
Фактор роста эндотелия сосудов стимулирует неоангиогенез, что усиливает восстановление тканей. Растворимые цитокины способствуют миграции, адгезии, пролиферации клеток, что ускоряет биоинтеграцию, ремоделирование и биодеградацию ВКМ.
Наличие описанных компонентов в составе биоматериала после всех этапов обработки и стерилизации определяет его основные физико-химические и биологические характеристики. Разрушение коллагеновых волокон будет сопровождаться снижением прочностных характеристик биоматериала, нарушение эластических волокон приведет к потере эластических свойств. Помимо физико-механических характеристик, потеря компонентов ВКМ может сказаться на гидрофильности биоматериала, биосовместимости, скорости биодеградации и биоинтеграции, тканевой реакции на имплантацию. В связи с этим очевидным является необходимость строгого контроля всех этапов обработки сырья с целью получения внеклеточного матрикса для снижения риска потери ключевых компонентов нативной соединительной ткани. Функциональные свойства основных компонентов внеклеточного матрикса после обработки и стерилизации представлены в таблице 2 Основные компоненты коллагенового внеклеточного матрикса и их функции.
Компоненты | Функции |
Фибриллярные белки | |
Коллагены типов I, III, IV, VI, эластин | Пространственная архитектоника, механическая прочность, эластичность |
Гликопротеины и протеогликаны | |
Фибринонектин, ламинин | Клеточная адгезия, миграция, пролиферация |
Гликозаминогликаны: гиалуроновая кислота, хондроитинсульфаты, гепарансульфат, гепарин |
Связывание клеток и факторов роста, усиление миграции клеток к месту повреждения, ангиогенез, клеточная дифференциация и пролиферация, контроль размера и ориентации коллагеновых волокон |
Цитокины, факторы роста | Биологическая активность, клеточная сигнализация, ремоделирование в организме реципиента |
Исследование физикомеханических свойств коллагенового внеклеточного матрикса. Физико-механические свойства биоматериалов являются его важнейшими характеристиками и определяют область возможного применения.
Основными параметрами в биомеханике являются: относительное (процентное) удлинение, модуль упругости, максимальное напряжение до разрушения, максимальная нагрузка.
Когда к любому твердому телу прикладываются силы, объект деформируется относительно своих исходных размеров. В то же самое время внутри объекта возникают внутренние силы (напряжения). Полное удлинение зависит как от исходной длины, так и от площади поперечного сечения образца. Количественной мерой, характеризующей степень деформации, испытываемой телом, является его относительная деформация — безразмерная величина, характеризующая отношение удлинения к исходной длине образца.
Модуль упругости — отношение напряжения к соответствующей относительной деформации ниже предела пропорциональности. Если испытание производится при растяжении или сжатии, отношение напряжения к относительной деформации определяется как модуль Юнга. Максимальное напряжение, приводящее к разрушению, называется пределом прочности σ. Нагрузка, при которой происходит разрушение, называется максимальной нагрузкой (единицы МПа).
Изучение физико-механических характеристик образцов внеклеточного матрикса проводилось на испытательной установке Instron‑5944 BioPuls. Биоматериал оценивали по трем параметрам: модуль упругости, максимальная нагрузка и напряжение при растяжении при максимальной нагрузке.
Измерения проводили на 20 образцах каждой группы, для этого вырезали полоски размером 5×30 мм, толщину определяли с помощью измерительной головки Mitutoyo Absolute с точностью до 0,01 мм не менее чем в пяти точках. Физико-механические свойства биоматериалов напрямую зависят от компонентного состава нативной ткани, используемой в качестве сырья для его получения, сохранности волокон, толщины образцов. В эксперименте участвовали следующие группы образцов: внеклеточный матрикс толщиной 0,12–0,15 мм (ВКМ 1), внеклеточный матрикс толщиной 0,22–0,25 мм (ВКМ 2), в качестве группы сравнения — ксеноперикард (КП), являющийся одним из наиболее известных и широко используемых биоматериалов для регенерации мягких тканей. Толщина ксеноперикарда 0,3–0,4 мм.
При проведении измерений на испытательной установке INSTRON‑5944 BIO PULS образцы закрепляли с помощью пневматических зажимов, погружали в физиологический раствор (фото 4).
Расчет параметров производился автоматически.
Результаты, полученные при изучении физико-механических характеристик образцов ксеноперикарда и коллагенового внеклеточного матрикса на испытательной установке INSTRON‑5944 BIO PULS, представлены на графиках 5-7.
Отличия в физико-механических свойствах биоматериалов обусловлены разным соотношением фибриллярных белков в составе нативной ткани, используемой в качестве сырья. Модуль упругости образцов ВКМ 2 на 30 % выше относительно ксеноперикарда, что можно объяснить бóльшим содержанием эластических волокон, отвечающих за упругие свойства ткани. Значения максимального напряжения при растяжении и максимальной нагрузки для ВКМ 1 достоверно ниже по сравнению с ксеноперикардом на 32 и 30 % соответственно.
Заключение. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о возможности широкого применения полученного биоматериала для разработки и создания на его основе медицинских изделий для различных областей хирургии. К достоинствам данного материала можно отнести следующие параметры:
- регулируемую скорость биорезорбции за счет изменения количества межмолекулярных сшивок;
- возможность использования в качестве скаффолдов для адгезии и роста клеточных культур за счет пористой структуры материала, необходимой для питания клеток, и наличия в составе биоактивных компонентов, усиливающих адгезию и пролиферацию;
- наличие в составе биологически активных веществ, положительно влияющих на регенерацию тканей реципиента, стимулирующих ангиогенез, хемотаксис эндотелиальных и мультипотентных стволовых клеток, регулирующих пролиферацию и продукцию металлопротеиназ.
Это дает нам основание рекомендовать данный материал для дальнейших испытаний на биологических объектах, в частности, на культурах клеток.